La biodiversité constitue le fondement du fonctionnement des écosystèmes et de la stabilité des milieux naturels. Chaque espèce, qu'elle soit végétale ou animale, joue un rôle dans la régulation des cycles biologiques, la pollinisation, la qualité de l'eau, des sols et de l'air. Sa préservation est une obligation inscrite dans le Code de l'environnement, notamment à travers la protection stricte des espèces menacées et de leurs habitats.
Le projet de ligne nouvelle Bordeaux - Toulouse traverse des territoires riches en faune et en flore, où subsistent encore des milieux naturels remarquables. Les travaux préparatoires et les sondages géotechniques, même limités dans l'espace, peuvent provoquer des destructions d'habitats, des dérangements d'espèces, des pollutions ou des ruptures de continuité écologique. Ces effets peuvent concerner des espèces protégées au niveau national ou européen, comme la Loutre d'Europe, le Vison d'Europe, les chauves-souris, les amphibiens ou certaines espèces d'oiseaux d'eau.
Les enjeux sont d'autant plus importants que plusieurs de ces espèces figurent sur les listes rouges de l'Union internationale pour la conservation de la nature (UICN), dans des catégories allant de vulnérable à en danger critique d'extinction. Toute atteinte à leurs populations, même localisée, doit donc être strictement encadrée, justifiée et compensée selon des règles précises.